肿瘤来源的富含CDHR2的细胞外囊泡与肝窦内皮细胞上的ANPEP结合，从而促进胰腺导管腺癌细胞的跨内皮迁移

　　摘要肝转移是胰腺导管腺癌患者死亡的主要原因，但其分子驱动机制至今尚不明确。通过對临床样本进行转录组与蛋白质组综合分析，我们发现膜蛋白钙黏蛋白相关家族成员2（CDHR2）在胰腺导管腺癌的肝脏转移过程中起着关键作用。在原发肿瘤中，CDHR2的表达高于周围组织；在肝转移病灶中，其表达进

　　肝转移是胰腺导管腺癌患者死亡的主要原因，但其分子驱动机制至今尚不明确。通过對临床样本进行转录组与蛋白质组综合分析，我们发现膜蛋白钙黏蛋白相关家族成员2（CDHR2）在胰腺导管腺癌的肝脏转移过程中起着关键作用。在原发肿尊龙凯时瘤中，CDHR2的表达高于周围组织；在肝转移病灶中，其表达进一步升高；而在患者来源的血浆外泌体中，CDHR2含量显著增加，尤其在有肝转移的患者中表现最为突出。在人类胰腺导管腺癌细胞中敲低CDHR2可抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力；在动物模型中，该操作能减缓原发肿瘤的生长，重塑肿瘤微环境，并降低肝转移程度。从机制上来看，CDHR2与PDK1结合，促使PDK1-AKT（Thr308）通路活化，从而推动细胞增殖。同时，AKT的活性又与CDHR2被包装进外泌体有关，这使得内在信号传导与外泌体载货功能相衔接。由肿瘤产生的、富含CDHR2的外泌体会与肝窦内皮细胞上的氨基肽酶N（ANPEP）形成复合物，破坏内皮细胞间的连接，增强肿瘤细胞与内皮的黏附，进而促进细胞穿过内皮迁移。相应地，抑制ANPEP或特异性敲低其在肝脏中的表达可减少肿瘤在肝脏的定植，而预先使用含CDHR2

　　的外泌体则会加速这一过程。最后，通过系统给药的方式递送包裹着siCDHR2的外泌体，可抑制已形成的原发肿瘤，并显著减少肝转移。总体而言，我们的研究明确了肿瘤内在的CDHR2–PDK1–AKT（Thr308）通路，以及外泌体介导的CDHR2–ANPEP内皮激活机制，为利用siCDHR2治疗胰腺导管腺癌的肝转移提供了理论依据。

　　胰腺导管腺癌是一种极其致命的实体瘤，其特征为肿瘤间质丰富、微环境具有免疫抑制作用，且对系统性治疗存在固有抗性。总体而言，胰腺癌的5年相对生存率约为13%，而胰腺导管腺癌的这一比例甚至更低，尽管多年来人们一直在努力改善这一状况[1]。如此差的预后主要是由于胰腺导管腺癌容易早期且迅速发生转移，其中肝脏是最常见的远处转移部位，也会直接导致患者死亡[2]。即便在那些接受了根治性手术切除的患者中，大多数仍会因肝转移而复发，目前也缺乏针对推动肿瘤在肝脏定植的分子机制的特异性治疗手段[3]。因此，明确调控胰腺导管腺癌向肝脏转移的机制，是一项亟待解决的临床需求。

　　转移是一个多步骤的级联反应，其中扩散的肿瘤细胞必须先在血液循环中存活下来，更要突破目标器官的血管屏障，才能在 ??器官形成新的肿瘤病灶[4]。在肝脏中，这一血管屏障由肝窦内皮细胞构成，这类高度窗孔化的特殊内皮细胞是循环肿瘤细胞首先遇到的细胞屏障，也是肝脏转移前微环境的核心组成部分[5]。越来越多的证据表明，原发肿瘤会通过分泌外泌体，尤其是外囊泡，来远距离调控这一微环境。这些外泌体携带生物活性蛋白、脂质和核酸，能够到达远处器官，其表面的特定分子还能决定肿瘤向哪些器官转移[6]、[7]。然而，胰腺导管腺癌产生的外泌体所携带的、能够引导它们转移到肝脏并打破肝窦内皮细胞屏障、促使肿瘤细胞渗出的特定配体，至今仍未被明确识别。找到这样的配体-受体通路，是设计有效抗转移疗法的前提条件。

　　钙黏蛋白相关家族成员2（CDHR2）属于钙黏蛋白超家族中的一种含1,310个氨基酸的跨膜原钙黏蛋白，它能介导钙依赖性的微绒毛间黏附，同时也有助于维持上皮细胞的刷状缘结构。在原钙黏蛋白家族中，PCDH8/9/10/17/20等基因常常因为启动子区域过度甲基化而失活，从而在多种癌症中发挥肿瘤抑制作用。有研究显示，在肝癌中，CDHR2作为一种因甲基化而失活的肿瘤抑制因子，能够抑制AKT信号通路的活动[8]；但在胃癌中，它的表达却会上升，且与不良预后相关[9]。这些相互矛盾的观察结果表明，CDHR2的功能可能具有组织特异性，不能仅通过家族层面的规律来推断。这就引出了一个尚未解决的问题：这种蛋白质在不同肿瘤环境中的功能是如何发生改变的？不过，它在胰腺导管腺癌转移过程中的具体作用至今仍不清楚。由于对胰腺导管腺癌患者的血浆和组织检测显示其CDHR2水平较高，我们对32名患者进行了研究。研究发现，与周围组织相比，原发胰腺导管腺癌组织中的CDHR2含量明显更高；与对应的原发肿瘤相比，肝转移病灶中的CDHR2表达也有所上升；而且与健康供体的循环外泌体相比，患者来源的尊龙凯时外泌体中CDHR2含量显著更高，尤其在有肝转移的患者中达峰值。

　　在本研究中，我们揭示了一个此前未被发现的、推动胰腺导管腺癌肝转移的机制。在原发肿瘤中，CDHR2会与PDK1结合，促使AKT发生磷酸化，进而推动肿瘤细胞增殖，同时营造出一种免疫抑制且具有纤维化特征的微环境。与此同时，CDHR2会被装载到外泌体中，这一过程与AKT通路的活性密切相关，而且还会与四跨膜蛋白CD9共同作用，随后这些外泌体被输送到肝脏。在肝脏中，外泌体中的CDHR2会与肝窦内皮细胞上的氨基肽酶N（ANPEP）发生相互作用，而ANPEP是一种已知参与血管生成和细胞迁移的内皮细胞外肽酶[10]。CDHR2与ANPEP的相互作用会破坏内皮细胞间的连接，增加肝窦的通透性，从而促进循环肿瘤细胞穿过内皮迁移；而通过基因或药物手段抑制ANPEP的功能，则可以减少肿瘤在肝脏的定植。基于这一机制，我们设计了含有siCDHR2的肿瘤来源外泌体，通过系统给药的方式使用这种纳米疗法，结果发现它能够抑制原发肿瘤的生长，重塑原本复杂的肿瘤间质，同时显著减少肝转移。总体而言，我们的研究证实了CDHR2–ANPEP通路在胰腺导管腺癌肝转移过程中起着关键作用，且该通路具有药物干预的潜力，同时也为我们提供了一种基于外泌体的仿生治疗策略。

　　本研究已获得重庆人民医院伦理委员会的批准（批准号KY S2024-036-01），并且遵循《赫尔辛基宣言》的要求。所有参与者均签署了书面知情同意书。在组织样本收集方面，我们从32名胰腺导管腺癌患者身上获取了样本：其中包括20对原发肿瘤与对应正常周围组织的样本，以及12对原发肿瘤与对应肝转移病灶的样本。至于血浆外泌体的蛋白质组筛选工作，我们则

　　为了绘制胰腺导管腺癌进展过程中的转录组变化图谱，我们对预先收集的、尚未接受过任何治疗的肿瘤样本进行了RNA测序。20名处于I–II期疾病阶段的患者提供了原发肿瘤样本（PT12）及其对应的正常周围组织样本（NAT）；12名处于III–IV期疾病阶段的患者则提供了原发肿瘤样本（PT34）及其对应的肝转移病灶样本（LM）（见图1A）。我们发现，在PT12样本中，有918个基因的表达水平高于NAT样本；而在LM样本中，有490个基因的表达水平高于PT34样本。将这两组基因列表取交集后，我们得到了一组核心基因

　　肝转移是胰腺导管腺癌患者死亡的主要原因，但迄今为止，那些引导肿瘤向肝脏转移的外泌体配体，以及它们所结合的宿主受体，都尚未被明确识别[13]。通过结合不同患者群体中的组织转录组数据与血浆外泌体蛋白质组数据，我们发现了CDHR2就是这样的一个关键因素。它在原发肿瘤和转移病灶中都会表达升高，且在患者来源的外泌体中含量丰富，其功能涉及肿瘤内部和外部两个环境。在肿瘤细胞内部，CDHR2能够维持PDK1-AKT（Thr308）通路的活性

　　论文初稿撰写部分、验证部分、方法学部分、研究实施部分、统计分析部分、数据整理部分，

　　所有参与者或其法定代理人均已签署书面知情同意书，同意参与本研究并允许相关文章发表。同时，我们也严格保护了参与者的隐私权。

　　本研究中使用了器官或组织捐赠者提供的样本。这些样本属于人类生物材料，捐赠者或其近亲属或法定代理人均已同意将其用于本研究及文章发表。本研究所使用的样本并非来自已被处决的

　　本研究的所有数据均可在论文及其补充材料中找到，如有需要，也可向通讯作者索取。本文中报告的原始序列数据将会存放在中国国家生物信息中心。

　　作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

　　（项目编号GZNL2024A03006）、重庆市科技创新与应用发展专项重点项目（项目编号CSTB2022TIAD-KPX0170）、重庆市科卫联合医学研究重大项目（项目编号2024DBXM003）、国家自然科学基金（项目编号82273094）、海南省自然科学基金（项目编号823QN366）

　　? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

　　Rui WangYi WangShuting XiaoShuilin LiaoSongsong LiuXi ChenYin ZhouJingjing ShanQibin SongHuaizhi WangQiang ChenMing Dong

　　中国广东省广州市510120，广州医科大学第一附属医院，呼吸系统疾病国家重点实验室，广州医科大学