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　　1.本发明涉及生物医学组织工程技术领域，具体涉及一种超仿生类器官缓释支架的制备方法。

　　2.组织工程支架是组织工程的基础，其形态和微观结构决定了再生效率，及重建器官/组织的最终结构和功能，因此理想的组织工程支架需在大体形态、微观结构及理化性能等方面均达到仿生的需求，从而使得修复的器官/组织具有类天然的形态和功能。常规的支架合成方法包括静电纺丝法、热致相分离法、溶剂浇铸/粒子沥滤法、冷冻干燥法等，但通过这些技术所获得的支架结构均无法精准模拟天然组织的微观形貌，且大尺寸的支架也阻碍了其内部的营养交换，极大的限制了其应用。近些年，随着微观仿生的组织工程支架被日渐重视，快速成形技术，尤其是高精度3d打印技术被较为广泛的应用到组织工程领域，其为构造类器官/组织支架、促进目标细胞的快速粘附聚集并功能化提供了有利条件。目前打印精度最高的数字光处理(dlp)3d打印机，其精度可达20um，能近乎精准地复制出与生物体同样形貌的支架，满足了打印大部分类器官/组织的需求。特别地，dlp打印机能精准制造微孔、微通道等仿生结构，既有利于细胞募集于整个支架内部，也能促进微血管的快速形成，保证营养的交换和物质的流通。

　　3.此外，生长因子是具有诱导目标细胞增殖、分化、起生物功能效应的物质，也是组织工程支架中不可或缺的因素之一。由于大部分生长因子为蛋白类物质，在制备保存过程中容易降解或者失活，因此使用要求较为苛刻。而且，目前大多以吸附或者直接混合至支架材料的方式载入生长因子，该方法不可避免的导致了因子的爆发性释放，一方面未能实现其在整个再生重建过程中的功能性发挥，另一方面短期内大量的生长因子在局部聚集可能对周围组织产生不利影响，进而影响再生修复疗效。而若通过化学修饰的方式将其接枝到支架材料上也一定程度上影响其活力和功能的发挥。

　　4.因此，设计微观仿生的类器官组织工程支架，同时在保存生长因子活性的前提下，对其进行符合生理需求的控释是目前组织工程支架设计的重点和难点。

　　5.本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，并提供一种超仿生类器官缓释支架的制备方法。本发明将利用高精度dlp光固化3d打印技术，打印释药颗粒，并将颗粒载入至支架生物墨水中，进一步通过dlp打印机将所设计的类器官制造成型，实现类器官缓释支架的制备。

　　8.s1：通过三维软件，以间隔排布的阵列方式设计包含若干微米级释药颗粒的制备模型；

　　9.s2：依次将光引发剂和目标缓释药物溶解于光固化生物墨水溶液中，得到第一混合溶液；调节第一混合溶液的ph至中性，经0.22μm滤器过滤后得到无菌释药生物墨水；

　　10.s3：利用所述无菌释药生物墨水，通过数字光处理光固化3d打印机打印所述制备模型；洗去打印后的产物间未交联的无菌释药生物墨水，得到释药颗粒；

　　11.s4：将光引发剂溶解于光固化生物墨水溶液中，得到第二混合溶液；调节第二混合溶液的ph至中性，经0.22μm滤器过滤后得到无菌支架生物墨水；

　　12.s5：将所述释药颗粒均匀分散于所述无菌支架生物墨水中，得到载药支架生物墨水；

　　13.s6：利用所述载药支架生物墨水，基于数字光处理光固化3d打印机，按照通过三维软件预设的仿生类器官支架打印得到类器官缓释支架；

　　14.s7：洗去所得类器官缓释支架内未交联的载药支架生物墨水，得到超仿生类器官缓释支架。

　　15.作为优选，所述制备模型中包含4000个以阵列方式间隔排布的释药颗粒，每个释药颗粒均为直径200μm、高度100μm的实心圆柱结构。

　　16.作为优选，所述光固化生物墨水可根据临床实际需求，选择甲基丙烯酸酰化明胶、甲基丙烯酰化丝素蛋白、甲基丙烯酰化硫酸软骨素、甲基丙烯酰化透明质酸、甲基丙烯酰化壳聚糖等光固化水凝胶中的一种。

　　17.作为优选，所述步骤s2中，光引发剂为蓝光引发剂lap，目标缓释药物为人骨形态蛋白bmp-2，光固化生物墨水溶液为由甲基丙烯酸酰化明胶溶于医用生理盐水所得。

　　18.进一步的，所述第一混合溶液中，甲基丙烯酸酰化明胶的取代率为90％、质量浓度为10％，lap的质量浓度为0.5％，bmp-2的浓度为600ng/ml。

　　19.作为优选，所述步骤s4中，光引发剂为蓝光引发剂lap，光固化生物墨水溶液为由甲基丙烯酸酰化明胶溶于医用生理盐水所得。

　　20.进一步的，所述第二混合溶液中，甲基丙烯酸酰化明胶的取代率为90％、质量浓度为10％，lap的质量浓度为0.5％。

　　21.作为优选，所述载药支架生物墨水中，释药颗粒的体积占比为30％-50％。

　　22.作为优选，所述步骤s3中，将打印后的产物收集至磷酸盐缓冲溶液中多次洗涤，以去除未交联的无菌释药生物墨水。

　　23.作为优选，所述步骤s7中，将类器官缓释支架收集至磷酸盐缓冲溶液(pbs)中多次洗涤，以去除未交联的载药支架生物墨水。

　　25.1)本发明利用高精度dlp光固化打印机，批量打印制备微米级释药颗粒，其生产效率较高，打印时间30秒即可一次制备数量高达4000颗的释药颗粒，且颗粒间一致性高，尺寸波动在

　　10％内，远优于常规挤出式打印机所获得的微球结构。且其启动打印的材料需求量小，仅需500μl即可完成打印；材料利用率高，1ml的生物墨水即可以打印出不少于800μl的微颗粒，利用率大于80％。

　　26.2)本发明通过将释药颗粒载入到支架生物墨水，一体化打印组织工程支架，在最大限度保存生长因子活性的同时，实现其功能性缓释作用。

　　27.3)本发明利用dlp光固化打印机的高精度层层打印特点，能基于生理结构，超仿生

　　的打印模拟微观结构的类器官支架，同时由于微米级释药颗粒尺寸低于打印仿生支架时所需的精度，因此能实现释药颗粒和类器官支架的一体化打印，为制备类器官缓释支架提供新策略。

　　28.4)本发明通过高精度dlp光固化打印机，大批量均一化的打印制备了更小尺寸的释药颗粒，基于该小尺寸释药颗粒，能够允许制备得到精度更高的超仿生类器官缓释支架，使得其诱导的再生组织结构更近乎于生理状态。

　　29.图1.载释药颗粒的类器官支架和直接混合的类器官支架释药曲线.微米级释药颗粒的制备模型设计阵列(a)及粒径尺寸(b)；

　　32.下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。

　　34.本发明提供了一种超仿生类器官缓释支架的制备方法，该制备方法的具体步骤如下：

　　36.通过三维软件(本实施例采用的solidworks软件)，以间隔排布的阵列方式设计包含多个微米级释药颗粒的制备模型。如图2所示，为本实施例所设计的一种制备模型，其中，制备模型中包含4000个以阵列方式间隔排布的释药颗粒，每个释药颗粒均为直径200μm、高度100μm的实心圆柱结构，该种结构可以保证打印过程不相互黏连的同时，实现大批量均一化制造。

　　38.本实施例所选光固化生物墨水以光固化甲基丙烯酸酰化明胶(gelma)为例，目标缓释药物以人骨形态蛋白(bmp-2)为例，光引发剂为蓝光引发剂lap。首先利用医用生理盐水溶解gelma，随后依次将lap、bmp-2均匀溶解于gelma溶液中，得到第一混合溶液。随后调节第一混合溶液的ph至中性(本实施例中为7.4)，经0.22μm滤器过滤后即得到释药gelma生物墨水。

　　39.以相同的方法制备载血管内皮生长因子(vegf)的释药gelma生物墨水。

　　40.在本实施例中，第一混尊龙凯时科技合溶液中，甲基丙烯酸酰化明胶的取代率为90％、质量浓度为10％，lap的质量浓度为0.5％，bmp-2的浓度为600ng/ml，vegf的浓度为200ng/ml。

　　42.将步骤2)得到的两种释药gelma生物墨水分别装入dlp光固化3d打印机的墨水槽内，分别层层打印步骤1)在solidworks软件上设计的释药颗粒模型，打印完毕后用刮刀将其收集至磷酸盐缓冲溶液中，洗涤5min，共3次，以洗去未交联的释药生物墨水，分别得到若干bmp-2释药颗粒和vegf释药颗粒。

　　44.本实施例所选的光固化生物墨水以光固化甲基丙烯酸酰化明胶(gelma)为例，光引发剂为蓝光引发剂lap。首先利用20ml医用生理盐水溶解gelma，随后将光引发剂溶解于gelma生物墨水中，得到第二混合溶液。再调节第二混合溶液的ph至中性(本实施例中为7.4)，经0.22μm滤器过滤后即得到仿生骨支架gelma生物墨水。

　　45.在本实施例中，第二混合溶液中，gelma的取代率为90％、质量浓度为10％，lap的质量浓度为0.5％。

　　46.特别地，在上述释药生物墨水和支架生物墨水的制备过程中，可根据实际临床的不同需求，选用不同类型的光固化生物墨水材料，如甲基丙烯酰化丝素蛋白(silma)、甲基丙烯酰化硫酸软骨素(chsma)、甲基丙烯酰化透明质酸(hama)、甲基丙烯酰化壳聚糖(csma)等等。且此类光固化生物墨水的理化性能可调节区间大，可根据实际需求，如特定的生物学功能、降解率、释放率等选择不同类型、取代率、浓度的生物墨水。

　　48.将步骤3)所得的bmp-2释药颗粒加入到步骤4)所得到的10ml仿生骨支架gelma生物墨水，获得10ml载bmp-2释药颗粒类皮质骨支架生物墨水，同时将步骤3)所得的vegf释药颗粒加入到步骤4)所得到的另10ml仿生骨支架gelma生物墨水，获得载vegf释药颗粒类松质骨支架生物墨水，本实施例中采用的释药颗粒体积占比均为40％。随后超声震荡5min以使得释药颗粒均匀分散于仿生骨支架gelma生物墨水中，即可得到类皮质骨载药支架生物墨水和类松质骨载药支架生物墨水。

　　50.通过三维软件设计仿生类器官支架，以仿生骨组织支架为例，分别设计类皮质骨支架和类松质骨支架，并将载药支架生物墨水倒入dlp光固化打印机的墨水槽内，按照预设的仿生类器官支架设计，设置层高200μm，分别将类皮质骨支架和类松质骨支架打印成形，得到类器官缓释支架。

　　52.利用刮刀将步骤6)所得的类器官缓释支架收集至适量pbs溶液中，洗涤5min，共3次，以洗去未交联的支架生物墨水，而后将两者取出，在滤纸稍作沥干，在类皮质骨支架和类松质骨支架的结合界面，涂布含lap的gelma生物墨水，将两者组装为类骨组织支架，405nm蓝光光固化1min，即完成超仿生类器官缓释支架的制备。

　　53.所得类器官缓释支架示意图如图3所示，从图中可以看出，人骨形态蛋白(bmp-2)释药颗粒均匀分散于类皮质骨支架层，血管内皮生长因子(vegf)释药颗粒均匀分散于类松质骨支架层，将类皮质骨支架层和类松质骨支架层组装后得到类骨组织支架。

　　54.特别的，若所需类器官支架为梯度分层微结构，如骨软骨缺损，可按上述方法，先打印载促软骨生长因子的释药颗粒，而后设计并打印载释药颗粒的仿生软骨支架，以同样的方法获得载释药颗粒的仿生软骨下骨支架，最后用光固化生物墨水分别涂布于两层支架的软骨-骨界面并进行组装，光固化后获得超仿生软骨-骨缓释复合支架。

　　55.为了进一步验证通过本发明制备方法所得超仿生类器官缓释支架的优异性能，还进行了对比实验，具体如下：

　　56.利用上述方法，获得含bmp-2释药颗粒的gelma仿生骨支架，同时，通过将bmp-2和lap直接溶解于gelma溶液中，打印获得直接混合的gelma仿生骨支架，将两者分别置于

　　0.5u/ml的胶原酶溶液中，每2天取上清计算仿生骨支架中bmp-2的释放量，绘制释放曲线所示。从图中可以明显的看出将bmp2制成释药颗粒后载入gelma仿生骨支架能显著延缓其释放速度，为仿生骨支架行使更佳的成骨功能提供有利条件。

　　57.本发明旨在利用高精度dlp光固化打印机，打印超仿生类器官支架，同时将微米级功能性释药颗粒一体化打印至支架内部，实现药物精准控释，为该组织工程超仿生类器官缓释支架行使再生重建功能提供有利条件。

　　58.以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

　　技术研发人员：谢志坚 史洋 张淳 陆炜英 喻康 贺永 石珏 陈卓 宓锐

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